Головна Головна -> Реферати українською -> Дисертації та автореферати -> реферат українською: Індукція каталітичної активності плазміногену моноклональним антитілом IV-1c

Індукція каталітичної активності плазміногену моноклональним антитілом IV-1c / сторінка 5

Назва:
Індукція каталітичної активності плазміногену моноклональним антитілом IV-1c
Тип:
Реферат
Мова:
Українська
Розмiр:
21,83 KB
Завантажень:
151
Оцінка:
 
поточна оцінка 5.0

Скачати цю роботу безкоштовно
Пролистати роботу: 1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14 
4, хромогенний субстрат S-2251 (0,3 мМ). Реагенти змішували при кімнатній температурі, реакцію проводили при 37оС.
Вплив двовалентних катіонів на індукцію каталітичної активності Глу-плазміногену моноклональним антитілом IV-1c. Хлориди двовалентних металів розчиняли у 0,1 М трис – HCl буфері, pН 7.4 до кінцевої концентрації 1,5 мМ. Цей буфер правив за основний під час реакції.
Вплив іонної сили розчину та аніонів на реакцію активації Глу-плазміногену моноклональним антитілом IV-Ic. Іонну силу розчину змінювали за допомогою хлориду натрію, вплив аніонів визначали, додаючи відповідні натрієві солі.
Електрофорез у поліакриламідному гелі за присутності ДС-Na. Електрофорез проводили за методом Laemmli. Як маркери використовували LMW Calibration Kit (Amersham Biosciences, США) до якого входять такі білки: 94 кДа – фосфорилаза Б, 67 кДа – альбумін, 43 кДа – овальбумін, 30 кДа – карбоангідраза, 20,1 кДа – соєвий інгібітор трипсину, 14,4 кДа – a-лактальбумін.
Електрофорез у поліакриламідному гелі за низьких значень рН. Для визначення форм плазміногену людини використовували 7.5% ПААГ з вмістом 6.25 М сечовини з доведенням рН оцтовою кислотою до 3.2. За таких умов розділення Глу- та Ліз- плазміногенів відбувається за рахунок різниці зарядів молекули.
Одержання стрептокінази. Стрептокіназу одержували з комерційного препарату (Kabikinase, Швеція) афінною хроматографією на Cibacron Blue-Sepharose. Питома активність препаратів стрептокінази була не меншою за 97000 IU/мг білка. За даними електрофорезу препарати стрептокінази не містили домішок альбуміну та були гомогенними.
Очищення імуноглобулінів. Антиплазміногенове моноклональне антитіло IV-1c отримували з супернатантів гібридомних клітин, люб’язно наданих старшим науковим співробітником Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України Іриною Миколаївною Колесніковою. До клітинного супернатанту додавали сульфат амонію до кінцевої концентрації 45 – 50% і залишали на 10 годин при 4оС. По тому центрифугували протягом 30 хвилин за 2000 об./хв на центрифузі РС-6. Супернатант видаляли, а до преципітату додавали 0,05М трис-HCl буфер, рН 7,4, з вмістом 0,13М NaCl до повного розчинення осаду та діалізували проти того ж буферу.
Отримання моноклональних антитіл IV-lc методом афінної хроматографії з використанням протеїн А-Sepharose. На колонку з протеїн А-Sepharose наносили віддіалізовані імуноглобуліни, відмивали незв'язаний білок 0,05М трис-HCl буфером, рН 7,4, з вмістом 0,13М NaCl з відповідним спектрофотометричним контролем за довжини хвилі 280 нм. Елюцію проводили 0.1 М гліциновим буфером, рН 2,8. Елюат негайно нейтралізували 1М трис до pH 7.8. Фракції діалізували проти 0,05М трис-HCl буферу, рН 7,4, з вмістом 0,13М NaCl або 50 мМ натрій-фосфатного буферу, рН 7,4, протягом ночі при температурі 4оС.
Очистка антиплазміногенового моноклонального антитіла IV-1c методом афінної хроматографіі на колонці з Пг-Sepharose. Ha врівноважену 0,05М трис-HCl буфером, рН 7,4, з вмістом 0,13М NaCl або 50 мМ натрій-фосфатним буфером, рН 7,4, колонку з плазміноген-Sepharose наносили фракцію імуноглобулінів. Незв'язаний білок відмивали тим же буфером. Елюцію проводили послідовно 0.1 М гліциновим буфером, рН 2,8 та рН 2.2. Елюат нейтралізували 1М трис до рН 7,8. Отримані антиплазміногенові IgG діалізували протягом ночі при 4оС проти 0,05М трис-HCl буферу, рН 7,4, з вмістом 0,13М NaCl. Елюйовані за рН 2.2 антитіла IV-1c мали здатність інгібувати індукцію каталітичної активності плазміногену стрептокіназою та індукувати таку активність самі.
Контроль наявності домішок з амідолітичною активністю у препаратах моноклонального антитіла IV-1c. Чистоту фракції імуноглобулінів після плазміноген-Sepharose контролювали електрофоретично, наявності білкових домішок не виявлено. Можливість наявності амідолітичної активності перевіряли, інкубуючи препарат антитіл з урокіназою та S2251 за стандартних умов. Протягом 10 годин інкубації амідолітичної активності у препаратах не виявлено.

Завантажити цю роботу безкоштовно

Пролистати роботу: 1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14 
Реферат на тему: Індукція каталітичної активності плазміногену моноклональним антитілом IV-1c

BR.com.ua © 1999-2019 | Реклама на сайті | Умови використання | Зворотній зв'язок