Загрузка...
Головна Головна -> Реферати українською -> Дисертації та автореферати -> Скачати реферат: ІДЕНТИФІКАЦІЯ ТА ХАРАКТЕРИСТИКА НОВИХ ГЕНІВ ЛЮДИНИ З ВИКОРИСТАННЯМ NotI-“ЗВ’ЯЗУВАЛЬНИХ” БІБЛІОТЕК

Загрузка...

ІДЕНТИФІКАЦІЯ ТА ХАРАКТЕРИСТИКА НОВИХ ГЕНІВ ЛЮДИНИ З ВИКОРИСТАННЯМ NotI-“ЗВ’ЯЗУВАЛЬНИХ” БІБЛІОТЕК / сторінка 4

Назва:
ІДЕНТИФІКАЦІЯ ТА ХАРАКТЕРИСТИКА НОВИХ ГЕНІВ ЛЮДИНИ З ВИКОРИСТАННЯМ NotI-“ЗВ’ЯЗУВАЛЬНИХ” БІБЛІОТЕК
Тип:
Реферат
Мова:
Українська
Розмiр:
16,92 KB
Завантажень:
198
Оцінка:
 
поточна оцінка 5.0
Загрузка...
Скачати цю роботу безкоштовно
Пролистати роботу: 1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11 
Цикли починалися 1,5 хвилинами денатурації при 95оС. В усіх експериментах використовували ампліфікатор Gene Amp PCR System 2400 (Perkin Elmer, США).
5’- та 3’-RACE виконували за допомогою набору реактивів “Marathon ready cDNA” (Clontech, США) згідно з протоколом виробника, використовуючи специфічний для певного гена праймер та універсальний праймер АР1. Другий ПЛР проводили із вторинним (nested) специфічним праймером та універсальним праймером АР2.
Для проведення зворотно транскрипційної полімеразної ланцюгової реакції використовували набір реактивів “SuperScript one-step RT-PCR system” (Life Technologies, США) згідно з протоколом виробника. Кожну реакцію виконували з 0,5 мкг тотальної РНК.
Продукти ПЛР були вирізані та елюйовані з агарозного гелю за допомогою набору реактивів “QIAquick gel extraction kit” (Qiagen, Німеччина). Для клонування продуктів ПЛР використовували набір реактивів “TOPO TA cloning kit for sequencing” (Invitrogen). Для трансформації використовували компетентні клітини штаму XL, які були приготовані власноруч за методом Mandel та Higa (Mandel and Higa, 1970), або компетентні клітини ТОР 10 (Invitrogen). Ізолювання плазмідної ДНК проводили за допомогою методу лужного лізису (Sambrook et al., 1989), а також наборів реактивів “GFX micro plasmid kit” (AmershamPharmaciaBiotech, Швеція) та “Qiagen plasmid kit” (Qiagen, Німеччина).
Для Нозерн-блот гібридизації використовували МТN фільтр (Clontech, США), який містив 2 мкг мРНК з різних тканин людини. Фільтр було гібридизовано протягом 14-16 годин при температурі 42оС у розчині, який містив 50% формаміду, 5 розчин Денхардта, 5 SSC, 0,5% SDS, 100 мкг денатурованої ДНК сперми лосося на 1 мл розчину. Після гібридизації фільтр відмивали протягом 20 хвилин при кімнатній температурі у розчині, який містив 2 SSC та 0,1% SDS, та протягом 20 хвилин при 50оС у розчині, який містив 0,2 SSC та 0,1% SDS.
Для скринінгу серцевої кДНКової фагової бібліотеки (Stratagene, США), для створення якої було використано праймер oligo(dT), виcівали 1 мільйон фагових бляшок на 20 чашок Петрі діаметром 145 мм (50 000 фагових бляшок на чашку Петрі). З кожної чашки Петрі знімали дві репліки на мембрану Hybond XL (Amersham, Велика Британія). Кожну мембрану було інкубовано в денатуруючому розчині (1,5М NaCl, 0,5M NaOH) протягом 2-5 хвилин та в нейтралізуючому розчині (1M трис-НCl, pH8,0, 1,5M NaCl) протягом 5 хвилин. ДНК було зафіксовано до мембрани прогріванням при температурі 80оС протягом 2 годин. Гібридизацію проводили протягом 14-16 годин при температурі 65оС у розчині, який містив 5 розчин Денхардта, 5 SSC, 0,5% SDS, 100 мкг денатурованої ДНК сперми лосося на 1 мл розчину. Після гібридизації фільтр відмивали двічі протягом 30 хвилин при 60оС у розчині, який містив 2 SSC та 0,1% SDS, та двічі протягом 30 хвилин при 60оС у розчині, який містив 0,2 SSC та 0,1% SDS.
Гібридизацію in situ проводили з нормальними метафазними хромосомами, як описано А.І. Протопоповим (Protopopov et al., 1996). Було проаналізовано 60 клітин на стадії метафази.
Пошук гомологій до нуклеотидної послідовності NotI-“зв’язувальних” клонів проводили за допомогою програм BLASTN та BLASTX (Altshul et al., 1990; Gish et al., 1993).
Для пошуку білкових доменів застосовували сервер ISREC (http://www.isrec.isb-sib.ch/software/PFSCAN_form.html). Ідентифікацію білкових трансмембранних регіонів у виведеній амінокислотній послідовності білка hUNC93 людини виконували за допомогою програми Tmpred (http://ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html).
Отримані результати та їх обговорення
Аналіз нуклеотидної послідовності NotI-”зв’язувальних” клонів
Е.Р. Забаровським та співробітниками було створено шість NotI-”зв’язувальних” бібліотек, використовуючи геномну ДНК клітинної лінії CBMI-Ral-Sto (Zabarovsky et al., 1994), з яких нами було відібрано та секвеновано 22 551 унікальний клон. Для кожного NotI-“зв’язувального” клона було визначено в середньому до 1000 п.н.
Нуклеотидні послідовності 22 551 унікального NotI-”зв’язувального” клона людини, які відповідають нуклеотидній послідовності 0,006% геному, використано для пошуку гомологій до відомих генів-гомологів та генів-ортологів із баз даних EMBL, GenBank і DDBJ.
Загрузка...

Завантажити цю роботу безкоштовно
Пролистати роботу: 1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11 
Реферат на тему: ІДЕНТИФІКАЦІЯ ТА ХАРАКТЕРИСТИКА НОВИХ ГЕНІВ ЛЮДИНИ З ВИКОРИСТАННЯМ NotI-“ЗВ’ЯЗУВАЛЬНИХ” БІБЛІОТЕК

BR.com.ua © 1999-2018 | Реклама на сайті | Умови використання | Зворотній зв'язок