Головна Головна -> Реферати українською -> Дисертації та автореферати -> Скачати реферат: Функціональна взаємодія кінази S6 рибосомного білка S6K1 та протеїнкінази 2

Функціональна взаємодія кінази S6 рибосомного білка S6K1 та протеїнкінази 2 / сторінка 4

Назва:
Функціональна взаємодія кінази S6 рибосомного білка S6K1 та протеїнкінази 2
Тип:
Реферат
Мова:
Українська
Розмiр:
21,45 KB
Завантажень:
169
Оцінка:
 
поточна оцінка 5.0


Скачати цю роботу безкоштовно
Пролистати роботу: 1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14 
Ампліфіковану і плазмідну ДНК розщеплювали відповідними ендонуклеазами рестрикції. Очищені фрагменти ДНК лігували, використовуючи ДНК лігазу фірми “Fermentas” (Литва) згідно з протоколом виробника.
Для одержання мутантних форм S6K1, що містили точкові мутації, використовували набір для мутагенезу “Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit” (“Stratagene”, США). Нуклеотидну послідовність кДНК отриманих мутантних форм S6K1 визначали за допомогою автоматичного секвенатора ABI 377 (“Applied Biosystem”, США).
Трансфекцію клітин НЕК293 та NIH3T3 плазмідними ДНК здійснювали, використовуючи реагенти ExGene (“Fermentas”, Литва) та Lipofectamine 2000 (“Invitrogene”, США), згідно з протоколами виробників. Через 24 години після трансфекції середовище замінювали на безсироваткове та клітини інкубували ще 36 годин. Стимуляцію клітин здійснювали додаванням ембріональної сироватки телят до кінцевої концентрації 10%. В експериментах із використанням інгібіторів кіназ клітини інкубували у присутності зазначених концентрацій рапаміцину (15 хв) чи TBB (4,5,6,7-тетрабромобензотриазол) (3, 6, 9 годин) перед стимуляцією сироваткою, або ж інгібітори у зазначених концентраціях додавали у середовище.
Імунопреципітацію рекомбінантних форм кіназ, злитих із ЕЕ-таг епітопом та рекомбінантних форм СК2 та СК2/? з Мус-таг епітопом та НА-епітопом відповідно, здійснювали, інкубуючи лізати клітин із анти-ЕЕ-таг, анти-Мус-таг та анти-НА-таг моноклональними антитілами і білок-А-сефарозою (“GE-healthcare”, CША). Аналіз імунопреципітатів проводили методом Вестерн-блот аналізу.
Активність S6К1 в імунопреципітатах визначали, використовуючи як субстрат 40S субчастинки рибосом, очищені з гомогенату печінки щура (Thomas et al., 1978). Продукти кіназної реакції розділяли електрофорезом у 12,5%-му поліакриламідному гелі, а рівень фосфорилювання S6 білка визначали за допомогою PhosphorImager(„BioRad”, Велика Британія).
Активність СК2 визначали, використовуючи рекомбінантну СК2 (“NEB”, США) згідно рекомендацій виробника. Продукти кіназної реакції розділяли електрофорезом у поліакриламідному гелі, а рівень фосфорилювання S6K1 або казеїну визначали за допомогою PhosphorImager.
Для імунофлуоресцентних досліджень використовували клітини лінії NIH3T3, що були трансфіковані відповідними плазмідами. Клітини фіксували 4%-им параформальдегідом та обробляли відповідними антитілами. Флуоресцентно мічені клітини досліджували за допомогою конфокального лазерного сканувального мікроскопа Zeiss LSM510, а зображення аналізували за допомогою програми LSM510.
Збагачені ядерні фракції клітин NIH3T3 та НЕК293 отримували згідно з описаною раніше методикою, чистоту отриманих фракцій аналізували Вестерн-блотом за допомогою специфічних антитіл: проти -тубуліну – маркеру цитоплазматичної фракції, проти ламіну А/С або топоізомерази-І – маркерів ядерної фракції.
Результати досліджень та обговорення.
Розробка високоефективного методу трансформації клітин дріжджів штаму EGY-48 кДНК бібліотекою клітинної лінії HeLa. Для пошуку білків-партнерів S6K1 в роботі було використано двогібридну систему дріжджів. Пошук білків-партнерів цим методом передбачає на першому етапі проведення великомасштабної трансформації клітин дріжджів кДНК бібліотекою. Стандартний протокол трансформації середньостатистичної кДНК бібліотеки (106 незалежних клонів) вимагає розсіву клітин-трансформантів на більш ніж двадцять чашок діаметром 150мм при густині колоній 5/мм2. Такий підхід є трудомістким, вимагає великої кількості реактивів, а головне – ріст колоній на чашці є нерівномірним, що стає причиною втрати цілісності бібліотеки. Розроблений нами підхід, який оптимізований для трансформації за допомогою ацетату літію, дозволяє отримати високу ефективність трансформації та забезпечує рівне оточення для росту кожної колонії, таким чином успішно зберігаючи цілісність первинної бібліотеки. Протокол було розроблено базуючись на кількох опублікованих методиках, однак саме внесені модифікації дозволяють використовувати меншу кількість реактивів для досягнення тієї ж ефективності трансформації.

Завантажити цю роботу безкоштовно
Пролистати роботу: 1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14 



Реферат на тему: Функціональна взаємодія кінази S6 рибосомного білка S6K1 та протеїнкінази 2

BR.com.ua © 1999-2017 | Реклама на сайті | Умови використання | Зворотній зв'язок