Головна Головна -> Реферати українською -> Дисертації та автореферати -> Скачати безкоштовно: Функціональна взаємодія кінази S6 рибосомного білка S6K1 та протеїнкінази 2

Функціональна взаємодія кінази S6 рибосомного білка S6K1 та протеїнкінази 2 / сторінка 7

Назва:
Функціональна взаємодія кінази S6 рибосомного білка S6K1 та протеїнкінази 2
Тип:
Реферат
Мова:
Українська
Розмiр:
21,45 KB
Завантажень:
169
Оцінка:
 
поточна оцінка 5.0


Скачати цю роботу безкоштовно
Пролистати роботу: 1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14 
Комплекси СК2 імунопреципітували з лізатів за допомогою анти-Мус та анти-НА антитіл, відповідно, з подальшим їхнім аналізом з використанням анти-S6K1 антитіл. Як видно з рис. 4А, ендогенна S6K1 взаємодіє з усіма субодиницями СК2. Неможливо зробити висновок про те, з якою із субодиниць ендогенна S6K1 взаємодіє ефективніше, оскільки рівень експресії субодиниць СК2 є різним (рис.4Б). Однак можна припустити, що ендогенна S6K1 може взаємодіяти з повним ферментом СК2 (вв’). Із літературних даних відомі факти про білки-субстрати СК2, що специфічно взаємодіють лише з певними каталітичними субодиницями СК2, наприклад, димером СК2 або ж ’ субодиниць. Згідно наведених даних, ендогенна S6K1 специфічно взаємодіє з усіма субодиницями СК2 in vivo.
Для підтвердження взаємодії між S6K1 та СК2 на рівні ендогенних білків було обрано інший підхід, а саме – присутність білка в комплексі виявляли не Вестерн-блот аналізом, а за продуктами його специфічної ферментативної активності.
Цей підхід є чутливішим, а з іншого боку дозволяє встановити, чи активні білки у комплексі. Відповідно, присутність СК2 в імунопреципітатах анти-S6K1 антитіл, отриманих із лізатів клітин НЕК293, визначали за СК2 кіназною активністю іn vitrо. При цьому використовували специфічний для СК2 субстрат – казеїн. Для визначення впливу мітогенних стимулів на утворення комплексу між СК2 та S6K1 клітини НЕК293 культивували у безсироватковому середовищі або стимулювали додаванням сироватки. Крім того, для підтвердження специфічності кіназної реакції іn vitrо клітини також попередньо обробляли ТВВ, що є прямим та селективним інгібітором СК2. З’ясувалося, що ендогенна СК2 ко-преципітується з ендогенною S6K1 не залежно від присутності ростових факторів, а активність СК2, принаймні у комплексі з S6K1, була нечутливою до стимуляції ростовими факторами, однак інгібувалася за умов додавання до середовища ТВВ.
Для того, щоб з’ясувати, чи активна S6K1 в комплексі з СК2, було імунопреципітовано тимчасово надекспресовану СК2 субодиницю, а S6K1 у комплексі виявляли за S6K1 кіназною реакцією іn vitrо. Як і в попередньому експерименті, для того, щоб підтвердити, що виявлено активність саме S6K1 до клітин додавали інгібітор S6K1 – рапаміцин, як наслідок активність S6K1 в комплексі з СК2 при цьому суттєво зменшувалася.
Аналіз СК2 опосередкованого фосфорилювання іn vitro повнорозмірної та N-кінцевого пептиду S6K1. Оскільки СК2 та S6K1 є протеїнкіназами, і мотиви фосфорилювання для них вже відомі, було проведено комп’ютерний аналіз первинних послідовностей СК2 та S6K1 на присутність потенційних сайтів фосфорилювання. Було знайдено чотири потенційні сайти фосфорилювання для СК2 в S6K1: Ser 17, Ser 357, Ser 375 та Thr 376, де Ser 17 є найбільш імовірним. Для перевірки результатів біоінформаційного аналізу проведено реакцію іn vitro фосфорилювання S6K1 рекомбінантною СК2. Для цього використовували рекомбінантну S6K1, експресовану в бакуловірусній системі, та рекомбінантну СК2 (New England BioLabs). Як видно з рис. 5А (доріжка 1), рекомбінантна СК2 здатна фосфорилювати S6K1. Для підтвердження локалізації сайту фосфорилювання як субстрат у кіназній реакції in vіtrо було використано пептид, що відповідає першим 45 амінокислотним залишкам з S6K1, і відповідно, містить найбільш імовірний сайт фосфорилювання Ser 17. За результатами кіназної реакції N-кінцевий пептид S6K1 (N/S6K1), і відповідно Ser 17 у його складі, є субстратом для СК2 іn vitrо (рис. 5Б).
СК2-залежне фосфорилювання S6K1 дикого типу та мутантної форми S6K1 S17А іn vitrо. Для підтвердження локалізації потенційного сайту фосфорилювання та подальшого виявлення фізіологічної ролі фосфорилювання в клітинах ссавців було проведено сайт-спрямований мутагенез залишка Ser 17 з його заміною на Glu або Ala. Надалі як субстрат СК2 у кіназній реакції іn vitro було використано S6K1 дикого типу та мутант – S6K1 S17А, надекспресовані в клітинах ссавців лінії НЕК293 з ЕЕ-таг епітопом та імунопреципітовані з використанням анти-ЕЕ антитіл.

Завантажити цю роботу безкоштовно
Пролистати роботу: 1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14 



Реферат на тему: Функціональна взаємодія кінази S6 рибосомного білка S6K1 та протеїнкінази 2

BR.com.ua © 1999-2017 | Реклама на сайті | Умови використання | Зворотній зв'язок