Головна Головна -> Реферати українською -> Дисертації та автореферати -> Скачати реферат: ВПЛИВ НІКОТИНУ НА ФУНКЦІЇ КЛІТИН В-ЛІМФОЦИТАРНОГО ПОХОДЖЕННЯ

ВПЛИВ НІКОТИНУ НА ФУНКЦІЇ КЛІТИН В-ЛІМФОЦИТАРНОГО ПОХОДЖЕННЯ / сторінка 4

Назва:
ВПЛИВ НІКОТИНУ НА ФУНКЦІЇ КЛІТИН В-ЛІМФОЦИТАРНОГО ПОХОДЖЕННЯ
Тип:
Реферат
Мова:
Українська
Розмiр:
23,96 KB
Завантажень:
197
Оцінка:
 
поточна оцінка 5.0


Скачати цю роботу безкоштовно
Пролистати роботу: 1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14 
О.В.Палладіна. Гібридому 1D6, яка є гібридом SP2/0 та нормальних лімфоцитів імунізованої миші і продукує моноклональні антитіла проти позаклітинного фрагменту (181–192) 3-субодиниці нікотинового ацетилхолінового рецептору щурів, було отримано, клоновано і охарактеризовано раніше у відділі молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна (Skok M.V. et al., 1999). Клітинні лінії пре-В лімфоми курчат DT40 та лімфоми Беркіта людини Ramos були люб’язно надані доктором біологічних наук С.П. Сидоренко (Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України).
Клітини культивували у культуральному середовищі RPMI 1640 (“Sigma”, США) з додаванням 20 мМ HEPES, 20 мМ L-глютаміну, 510-5 М -меркаптоетанолу, 50 мкг/мл пірувату натрію, 41 мкг/мл інсуліну, 40 мкг/мл гентаміцину і 10% ембріональної сироватки теляти (“Sigma-Aldrich”, США). Життєздатність клітин оцінювали під мікроскопом за включенням трипанового синього. Морфологічне дослідження клітин проводили після фарбування за методом Папенгейма-Крюкова. Кількість живих клітин у пробах визначали за включенням тріазолілу блакитного (3-4,5диметилтриазол-2-іл-2,5-дифенілтетразолію броміду (МТТ)) (“Sigma”, США), який вносили до культурального середовища до досягнення кінцевої концентрації 0,4 мг/мл. По чотиригодинній інкубації при 37°С утворені кристали формазану розчиняли у диметилсульфоксиді, до лунок додавали 0,1 М гліциновий буфер з 0,1 М NaCl, рН 10,5 і фотометрували планшети на фотометрі “StatFax 2100” (“Awareness Technology”, США) за довжини хвилі 540нм (Carmichael J. et al., 1987). Кількість
клітин визначали за допомогою попередньо побудованої калібрувальної кривої.
Співвідношення живих і мертвих клітин в суспензії оцінювали також за розміром і гранулярністю клітин методом проточної цитофлуориметрії в координатах пряме світлорозсіяння проти бокового на проточному цитофлуориметрі EPICS XL (“Beckman Coulter”, Франція). Кількість живих клітин визначали в області, що була попередньо встановлена за клітинами, які були підраховані з використанням трипанового синього.
Для вивчення поверхневої експресії нАХР клітинами досліджених ліній було використано метод клітинного імуноферментного аналізу. Суспензію клітин (1106 клітин/мл) в фізіологічному розчині, забуференому фосфатом (ЗФР), рН 7,2 – 7,4 з 0,5% бичачим сироватковим альбуміном (БСА, “Sigma”, США), вносили в лунки 96-лункових полістирольних планшетів для імуноферментного аналізу (ІФА) (“Nunc Maxisorp”, Данія), і фіксували висушуванням. Потому планшети блокували 1% розчином БСА (1 год. 37оС) і обробляли афінно-очищеними антитілами проти різних субодиниць нАХР (10 – 20 мкг/мл в ЗФР з 0,05% Твін 20 (ЗФР-Твін), 2 год., 37°С), отриманими і охарактеризованими раніше (Skok M.V. et al., 1999; Koval O.M. et al., 2004). Після відмивань ЗФР-Твіном планшети обробляли антитілами кози до імуноглобулінів G кроля, кон’югованих з пероксидазою, або кон’югатом екстравідину з пероксидазою (якщо антитіла були біотинільовані). Активність пероксидази проявляли розчином субстрату: 0,05 М фосфатний буфер, рН 6,0, з 0,01% перекису водню та 0,4 мг/мл о-фенілендіаміну (“Sigma”, США). Реакцію зупиняли додаванням 4Н розчину сірчаної кислоти та фотометрували за довжини хвилі 492 нм на фотометрі “StatFax 2100” (“Awareness Technology”).
Для вивчення поверхневої експресії 7-вмісних нАХР також було проведено експерименти з вивчення зв’язування -кобратоксину, міченого флуоресцентною міткою ФІТЦ (ізотіоціанат флуоресцеїну). Зв’язування -кобратоксину не є видоспецифічним, що дозволяє використовувати його на клітинних лініях різного видового походження. Клітини вносили в пробірки для аналізу, 1106 клітин на пробу в ЗФР з 1% БСА, інкубували протягом 15 хв. при 4оС з ФІТЦ-міченим -кобратоксином, оптимальну концентрацію якого визначали в попередніх експериментах.

Завантажити цю роботу безкоштовно
Пролистати роботу: 1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14 



Реферат на тему: ВПЛИВ НІКОТИНУ НА ФУНКЦІЇ КЛІТИН В-ЛІМФОЦИТАРНОГО ПОХОДЖЕННЯ

BR.com.ua © 1999-2017 | Реклама на сайті | Умови використання | Зворотній зв'язок