Головна Головна -> Реферати українською -> Дисертації та автореферати -> реферат українською: ВПЛИВ НІКОТИНУ НА ФУНКЦІЇ КЛІТИН В-ЛІМФОЦИТАРНОГО ПОХОДЖЕННЯ

ВПЛИВ НІКОТИНУ НА ФУНКЦІЇ КЛІТИН В-ЛІМФОЦИТАРНОГО ПОХОДЖЕННЯ / сторінка 5

Назва:
ВПЛИВ НІКОТИНУ НА ФУНКЦІЇ КЛІТИН В-ЛІМФОЦИТАРНОГО ПОХОДЖЕННЯ
Тип:
Реферат
Мова:
Українська
Розмiр:
23,96 KB
Завантажень:
197
Оцінка:
 
поточна оцінка 5.0


Скачати цю роботу безкоштовно
Пролистати роботу: 1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14 
По цьому зразок розводили ЗФР з 1% БСА і клітини аналізували на проточному цитофлуориметрі EPICS XL (“Beckman Coulter”, Франція).
В моделі in vivo мишей BALB/c (дві групи по 5 тварин) і білих безпородних щурів (дві групи по 10 тварин) утримували у віварії Інституту біохімії. Контрольні тварини споживали чисту воду, а дослідні групи – отримували нікотин (“Sigma”, США) з питною водою (миші – 200 мкг/мл, щури – 40 мкг/мл). Наприкінці експерименту мишей умертвляли цервікальною дислокацією, а щурів – передозуванням ефіру, вилучали їхні селезінки, еритроцити руйнували осмотичним шоком за допомогою спеціального розчину для лізису (“Sigma”, США), а білі клітини крові аналізували методом клітинного ІФА, як описано вище.
Для вивчення проліферації клітин досліджених ліній до лунок 96-лункових планшетів для культури тканин (“Falcon”, США) вносили суспензію клітин з щільністю 2,5104 клітин/мл та розчини досліджуваних речовин. Клітини культивували протягом 3-5 діб. Кількість живих клітин підраховували методом включення (МТТ), як описано вище, або за включенням трипанового синього за допомогою гемоцитометру.
Час подвоєння (“2”t) для популяції посіяних клітин вираховували згідно рівняння
“2”t=t ln2/(lnx–lnx0),
де t – час культивування клітин (в годинах); х0 – початкова кількість посіяних клітин; х – кінцева кількість отриманих після культивування клітин.
Кількість антитіл, секретованих гібридомою 1D6, визначали в культуральній рідині традиційним сорбційним ІФА. В якості антигену використовували пептид 3(181-192) нАХР, кон’югований з БСА. Планшети фотометрували за довжини хвилі 492 нм на фотометрі “StatFax 2100”.
Кількість клітин, що секретують антитіла, визначали методом імуноферментних відбитків. Клітини гібридоми, 5104 клітин/мл, культивували на нітроцелюлозних фільтрах (“Sigma”, США) за присутності чи за відсутності нікотину протягом 3 днів. Потім фільтри ретельно промивали ЗФР, обробляли антитілами кози проти імуноглобулінів G миші, кон’югованими з пероксидазою хрону (1 год., 37°С), і плями секретованих антитіл проявляли розчином субстрату, який містив 0,6 мг/мл 4-хлоро-1-нафтолу в 0,05 М фосфатному буфері з 0,01% Н2О2.
В іншій серії експериментів визначали, як нікотин впливає на кількість клітин, що секретують антитіла, утворених in vivo. Мишей BALB/c імунізували внутрішньочеревно гемоцианіном равлика (“Sigma”, США) в дозі 50 мкг/мишу 3 рази с інтервалом в 2 тижні. Першу імунізацію проводили з повним (“Calbiochem”, США), наступні – з неповним ад’ювантом Фрейнда (“DIFCO Laboratories”, США). Селезінки вилучали на 5-й день після останньої імунізації. Спленоцити, 5106 клітин/мл, культивували в 96-лункових планшетах (“Falcon”, США) з різними дозами нікотину або токсинів протягом 5 днів при 37°С в такому ж середовищі, як і клітини гібридоми. Для визначення кількості клітин, що секретують антитіла (АСК), клітини (2106 клітин/мл) переносили в лунки планшетів з нітроцелюлозними фільтрами (“Sigma”, США) на дні. На фільтрах попередньо адсорбували антиген (розчин гемоцианіну, 10 мкг/мл в ЗФР) і потім блокували 1% розчином овальбуміну. Клітини інкубували на фільтрах протягом 3 днів, після чого фільтри відмивали водою та ЗФР-Твін і обробляли кролячими антитілами проти імуноглобулінів миші (“Sigma”, США) 1 год. при 37°С. Відбитки АСК проявляли комплексом пероксидаза-анти-пероксидаза в ЗФР-Твін (1 год. при 37°С) і хромогенним субстратом, що містив 0,6 мг/мл 3-3’-діамінобензидину (“Sigma”, США), 0,013 % перекису водню і 0,03% хлориду кобальту в 50 мМ трис-HCl буфері рН 7,6. Кількість відбитків підраховували під бінокуляром з використанням масштабної мікросітки.
Штучні анти-адгезивні умови для культивованих клітин створювали за допомогою кліностату – приладу, який імітує умови мікрогравітації. Принцип його дії полягає в створенні вектора гравітації змінного напрямку шляхом обертання, в результаті чого клітини не мають можливості осісти і прикріпитися до підложки.

Завантажити цю роботу безкоштовно
Пролистати роботу: 1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14 



Реферат на тему: ВПЛИВ НІКОТИНУ НА ФУНКЦІЇ КЛІТИН В-ЛІМФОЦИТАРНОГО ПОХОДЖЕННЯ

BR.com.ua © 1999-2017 | Реклама на сайті | Умови використання | Зворотній зв'язок